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细胞因子,抗体检测诊断技术ppt

  • 素材大小:2.35 MB
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  • 更新时间:2017-11-08
  • 素材类别:仪器设备PPT
  • 素材上传:yangdong
  • 素材格式:.ppt
  • 关键提要:细胞因子,抗体检测诊断技术,抗体检测
  • 素材版本:PowerPoint2003及以上版本(.ppt)
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这是细胞因子,抗体检测诊断技术ppt,包括了背景知识,细胞因子的检测方法,酶联免疫吸附测定实验,实验原理,方法类型,试剂及仪器准备,操作步骤,基本操作注意事项,实验中常出现的问题,实验报告等内容,欢迎点击下载。

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细胞因子,抗体检测诊断技术ppt

PPT内容

细胞因子及抗体检测技术
背景知识
研究细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和指导临床治疗均具有重要意义
抗体具有高特异性、高亲和力等特点,目前已广泛应用于免疫学、微生物学、肿瘤学、遗传学以及分子生物学等各个领域
细胞因子的检测方法:
    1) 生物学方法 ①依赖性细胞株 :生物分析法
                  ②功能检测 :生物分析法
2) 分子生物学方法
          ①分子杂交技术 :mRNA表达水平的测定
          ②多聚酶链反应技术(PCR):mRNA的测定
3)免疫学方法 ①免疫测定 :免疫酶技术
                  ②功能测定与抗体抑制
抗体检测技术
免疫酶技术
免疫荧光技术
间接血凝试验
放射免疫测定
蛋白印迹
免疫共沉淀
亲和力测定
酶联免疫吸附测定实验                    (ELISA)       Enzyme linked immunosorbent assay
管晓虹(1946-2012),女,汉族,江苏丹阳人,博士,教授,博士生导师。农工民主党员。农工民主党第十二、十三届中央常委,第九、十届全国人大代表,江苏省妇联副主席。
1970年毕业于中国协和医科大学;1981和1985年先后在原南京医学院获医学硕士和医学博士学位;1988年在美国布朗大学作博士后研究。
曾任寄生虫学教研室副主任、江苏省医学分子生物学重点实验室主任、卫生部抗体技术重点实验室主任。
 承担国家“七五”、“八五”、“九五”科技攻关项目各1项(血吸虫病免疫诊断);国家“863”计划项目1项和国家自然科学基金项目6项;发表论文100余篇;主编或参编卫生部规划教材6部;获部省级科技进步二等奖2项、三等奖2项;获国家发明专利授权6项。获“全国优秀教师”、“国家级有突出贡献的中青年专家”等荣誉称号。享受国务院政府特殊津贴。
实验原理
是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫技术
此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速
优点:微量、特异、高效、经济、方便、安全等
广泛用于生物学和医学科学的许多领域
实验原理
        ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性
按一定步骤进行抗原抗体反应
加底物显色,根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析
方法类型
          ELISA既可测抗原又可测抗体,根据试剂来源、标本性状以及检测的具体条件,可设计出不同类型的检测方法:
     1.直接法
     2.间接法
     3.双抗体夹心法
     4.双夹心间接法
一、试剂及仪器准备
(一)  免疫吸附剂
1.固相载体
  ⑴ 要求:①  吸附力强
                   ②  能保持Ag或Ab活性
                   ③  不参与化学反应
⑵ 载体性能比较
   要求:载体材料+、- 结果差别大
   检测方法:10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG,显色后,测20孔的OD,要求CV<10%
⑶ 常用载体:
   材料:聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等
   形状:小试管、小珠、微量反应板
2. Ag或Ab:纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab):
 包被:将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法
 封闭:包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被,以消除非特异吸附的干扰
㈡ 酶结合物:
1. 要求:纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定
2. 常用酶:HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 底物:
HRP可溶性底物及呈色:
    邻苯二胺(OPD):橙红(492nm);四甲基联苯胺(TMB):蓝色(450nm)
    5-氨基水杨酸(5-ASA):棕色(550nm)   鲁咪诺+H2O2:荧光
HRP不可溶性底物及呈色:
     DAB:棕黄色  α-萘酚:红色  3-氧基-9-乙基卡唑:红色 4-氯-1-萘酚:灰蓝色
AP可溶性底物及呈色:
    对硝基苯磷酸酯(P-NPP):黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP):荧光
AP不可溶性底物及呈色:
    NBT和BCIP混合液:紫色   坚固红和萘酚ASMX混合液:红色
 ß-半乳糖苷酶:
    4-甲基伞基-ß-半乳糖苷:荧光
4. 酶结合物的制备:
  戊二醛交联法
过碘酸盐氧化法
(三)设备:酶标比色仪简称酶标仪
指测读ELISA光度计;针对固相载体形式的不同,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计
 性能指标:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性
 优良的酶标仪的读数一般可精确0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%
操作:室温宜在15-30℃,使用前先预热仪器15-30min,测读结果更稳定。测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读
二、操作步骤 (间接ELISA法)
样本的收集
包被抗原
封闭
加稀释的待检样品
加酶标抗抗体
加底物显色
终止反应
(一)样品的收集和保存:
   1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用
      于HRP的辅基);
   2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”
       (破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白);
   3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”;
   4. 陈旧标本可使IgG聚集,引起间接法本
       底增加;
   5. 标本中含NaN3,可出现假“-”。
(二)包被
 包被(coating):将抗原或抗体固定在固相载体的过程
原理:物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用;这种物理吸附是非特异性的
影响因素:受蛋白质分子量、等电点、浓度等
        大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面
 
包被条件
 pH9.6 碳酸盐缓冲液
 pH7.2 磷酸盐缓冲液
 pH7-8 Tris-HCl缓冲液。
 方法:加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置过夜或37℃中保温2小时。
 浓度:随载体和包被物的性质可有很大的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。  一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml
最适工作浓度的选择
     可用棋盘滴定法在夹心ELISA法中选择包被抗体和酶标抗体工作浓度,即利用棋盘滴定,将包被抗体和酶标抗体稀释成一系列浓度,反应后显色。阳性值在0.8左右,阴性值小于0.1为最适,可据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度
方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50~l:800)后,按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照),保温,洗涤。加工作浓度酶标抗体,洗涤,加底物显色,加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值;为0.8左右,阴性参考血清A值<0.1的包被抗原稀释度为工作浓度   
(三)封闭
封闭(blocking):是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。
常用封闭剂:0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉,可以高浓度使用(5%)。
(四)加样(抗原或抗体)
纯化抗原/抗体:天然但干扰多
合成抗原/抗体:多肽分子较小,常有空间位阻
基因抗原:与片段的选择和制备水平有关
对照设定
阳性对照品(positive control)
阴性对照品(negative control)
目的:
  是检验试验有效性的控制品,同时也作为判断结果的对照。
要求:
阳性对照品:基本组成应尽量与检测标本的组成相一致,多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称;在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可以估计标本物质的量
阴性对照品:须先行检测确定不含待测物质
(五)加酶标抗体
  酶标记的抗体(原):ELISA中关键的试剂
要求:
纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳定,来源丰富,价格不贵,受检标本中不存在相同的酶
酶结合物保留活性部分和催化能力,底物易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定等
在ELISA中,HRP,AP,葡萄糖氧化酶,β-D-半乳糖苷酶和脲酶等
(六)显色
显色:酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。
影响因素:温度、时间
  在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。
TMB:受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。
(七)结果判定
操作方法:拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。
结果判定:光密度(oplical density,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是将吸收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。
定性测定
    定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答,分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中,将标本作一系列稀释后进行试验,呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低,可以判断标本反应性的强弱,这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义
在间接法和夹心法ELSIA中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反,阴性孔呈色深于阳性孔
2. 定量测定
      ELSIA操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。
测定大分子量物质的夹心法ELISA,标准曲线的范围一般较宽,曲线的值逐点连接,所得曲线一般呈S形,其头、尾部曲线趋于平坦,中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
三、基本操作注意事项
(一)加样:
一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。
方法:加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。
(二)孵育
ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的孵育温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
(三)洗涤
        洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。
洗涤目的:达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质,以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中,洗涤是最主要的关键技术。
四、实验中常出现的问题
1. ELISA出现“一片黄”的原因:
 酶结合物浓度过高
 底物不新鲜
 洗涤不干净
2.ELISA出现“一片白”的原因:
 载体吸附性能差
 底物错
 稀释液作包被液
 加错试剂
 包被时间过短
 酶活力低或下降
 样品含有NaN3
间接ELISA法操作步骤
1.样本的收集;
2.包被抗原;
3.封闭;
4.加稀释的待检样品;
5.加酶标抗抗体;
6.加底物显色;
7.终止反应
实验报告
内容:实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、讨论与分析
要求:只接受纸质、手写体报告。
递交时间:2011年11月12日,张晓老师。
 

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《细胞因子,抗体检测诊断技术ppt》是由用户yangdong于2017-11-08上传,属于仪器设备PPT。

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